Narodna in univerzitetna knjižnica v svojih depojih hrani več kot 3 milijone enot knjižničnega gradiva, ki ga sestavljajo trije temeljni sklopi: temeljna nacionalna zbirka, zbirka temeljne znanstvene literature in zbirka posebnega knjižničnega gradiva.
Jedro predstavlja zbirka patriotike oziroma slovenike. To je temeljna nacionalna zbirka pisne dediščine slovenskega naroda. Vključuje vsa dela, ki so bila založena ali natisnjena v Sloveniji, se nanašajo na Slovenijo, so napisana v slovenskem jeziku oziroma so jih napisali slovenski avtorji. Zbirka slovenike ima status kulturnega spomenika, njeno hranjenje pa je osrednja naloga nacionalne knjižnice. Pri izpolnjevanju te naloge nam pomaga mehanizem obveznega izvoda, po katerem nacionalna knjižnica prejme brezplačne izvode vsake publikacije, izdane v Sloveniji. Četudi je NUK nacionalno funkcijo prevzela šele leta 1945, je slovenika, tudi po zaslugi zavednih knjižničarjev, del njene nabavne politike že več kot 200 let.
Podobno velja za zbirko temeljne znanstvene literature, katere začetki prav tako segajo na konec 18. stoletja. Licejska knjižnica, predhodnica današnje NUK, je bila zasnovana in ustanovljena kot prva javna znanstvena knjižnica na Slovenskem. Njen osnovni namen je bil služiti študijskim in raziskovalnim potrebam profesorjev in študentov novoustanovljenega liceja, kot tudi drugim izobražencem. Pridobivanje relevantne znanstvene in študijske literature, ki bi po eni strani pokrivala študijske programe ljubljanskih visokih, višjih in srednjih šol, po drugi pa služila širšim potrebam izobraženstva, je bila tako formalno kot v praksi glavna usmeritev pri gradnji knjižničnih fondov vse do konca 2. svetovne vojne.
Poglobljenemu znanstvenoraziskovalnemu in študijskemu delu so namenjene tudi posebne knjižnične zbirke. Za nacionalne knjižnice je značilno, da v okviru rednih nalog oblikujejo posebne specializirane fonde, za katere skrbijo knjižničarji, ki imajo odličen pregled nad posameznim področjem. V NUK deluje osem posebnih zbirk: Rokopisna zbirka, Zbirka starih tiskov, Glasbena zbirka, Kartografska zbirka, Slikovna zbirka, Zbirka drobnega tiska in sive literature, Zbirka knjižničnega gradiva Slovencev v zamejstvu in po svetu in Filmska zbirka.