Rokopisna zbirka in zbirka redkih tiskov
Rokopisna zbirka skupaj z zbirko redkih tiskov predstavlja srčiko narodne knjižnice že vse od njenega začetka. Hrani največji srednjeveški rokopisni fond in zbirko inkunabul v državi, z zbirko protestantike, redkimi izvodi stare slovenike ter novoveškimi rokopisi in zapuščinami slovenskih pesnikov in pisateljev pa deluje kot osrednji slovenski literarni arhiv.

Zbirka starih tiskov
Zbirka starih tiskov hrani gradivo iz obdobja med začetkom 16. stoletja in prvo polovico 19. stoletja. Jedro zbirke tvorijo knjige, ki so bile ob jožefinski reformi iz različnih samostanskih knjižnic predane nekdanji Licejski knjižnici. Tem se pridružujejo številni sočasni in kasnejši darovi ter nakupi iz zasebnih in drugih zbirk.

Glasbena zbirka
Najpopolnejša zbirka notnih tiskov in rokopisov slovenskih glasbenih del ter glasbenih zvočnih posnetkov, glasbenih revij, koncertnih sporedov in dokumentarnega gradiva slovenske glasbene ustvarjalnosti in poustvarjalnosti. Referenčna zbirka del iz svetovne glasbene zakladnice ter leksikalne in bibliografske literature o glasbenikih in glasbenih delih.

Kartografska zbirka
Kartografska zbirka Narodne in univerzitetne knjižnice hrani več kot 23 000 zemljevidov in več kot 2000 atlasov. Posebna dragocenost zbirke so starejši atlasi in zemljevidi iz obdobja od 16. do konca 18. stoletja, na katerih je prikazano tudi slovensko ozemlje. Pomembne so zbirke izredno natančnih avstrijskih topografskih kart s konca 19. in začetka 20. stoletja, jugoslovanskih državnih topografskih kart in temeljnih topografskih načrtov ter najnovejša slovenska kartografska produkcija.

Slikovna zbirka
Slikovna zbirka Narodne in univerzitetne knjižnice hrani litografije, plakate, razglednice, fotografije različnih žanrov, ekslibrise, koledarje in podobice ter akvarele in risbe slovenskih likovnih umetnikov. Med pomembnejšimi naslovi v zbirki so Valvasorjeve topografije, Vischerjeva topografija, Kaiserjeve litografije štajerskih mest in gradov ter akvareli in risbe Ivana Vavpotiča, Hinka Smrekarja in Maksima Gasparija.

Zbirka gradiva EU in mednarodnih organizacij
Zbirka združuje:
-     depozitno knjižnico gradiva Evropske unije;
-     depozitno knjižnico publikacij UNESCO;
-     depozitno knjižnico publikacij OECD.
Prejema še posamezne izdaje nekaterih drugih mednarodnih organizacij, kot so International Labour Organization (ILO) in Council of Europe.

Zbirka posebnega knjižničnega gradiva - PKG
V Zbirki PKG zbiramo, strokovno obdelujemo in hranimo drobni tisk in drugo posebno gradivo. Zbiramo predvsem kataloge, programe, učne pripomočke, koledarje, reklamno gradivo in informativno gradivo. Glavna značilnost tega gradiva je, da izhaja na nekonvencionalen način in v večini primerov ni dostopno preko redne knjigotrške mreže, torej ga ni mogoče kupiti.

Zbirka AV gradiva
Narodne in univerzitetne knjižnice zbira, strokovno obdeluje, hrani in daje v uporabo avdiovizualno gradivo: videokasete, DVD, avdiokasete, CD, knjige in revije s filmsko vsebino. V njej najdemo slovensko avdiovizualno produkcijo in nekatera temeljna dela evropske in ameriške filmske produkcije.

Zbirka serijskih publikacij
Narodne in univerzitetne knjižnica hrani največjo in najpopolnejšo zbirko serijskih publikacij v nacionalnem okviru od samih začetkov časnikarstva na slovenskem ozemlju do danes.

Zbirka tiskov Slovencev zunaj Republike Slovenije
Zbirka tiskov Slovencev zunaj Republike Slovenije je naslednica tako imenovanega D fonda (depozitarnega fonda), v okviru katerega so v Narodni in univerzitetni knjižnici v letih po drugi svetovni vojni zbirali in hranili publikacije, ki so bile prepovedane iz moralno-političnih razlogov.
Uradno je bil D-fond ustanovljen leta 1978 in imel do leta 1991 posebne pogoje dostopa.